新冠肺炎疫情的大流行使免疫學(xué)成為國際關(guān)注的焦點。該領(lǐng)域的研究人員一直在研究免疫系統(tǒng)對SARSCoV- 2 病毒的反應(yīng)，以了解人的身體是如何抵抗病毒感染的。免疫學(xué)檢測的進(jìn)步尤其依賴于一種儀器，流式細(xì)胞儀。

　　“流式細(xì)胞儀對我們了解傳染病很重要，”William Telford 表示，他是美國國家癌癥研究所流式細(xì)胞儀核心設(shè)施的負(fù)責(zé)人之一。 納米級流式細(xì)胞儀可以被用來描述 SARS-CoV-2 和其他病毒中發(fā)生的免疫變化。

　　William Telford 談到：“免疫細(xì)胞在顯微鏡下看起來非常相似。只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其表面顯露才能反映出更多的信息，比如T 細(xì)胞還是B 細(xì)胞；激活還是滅活；疾病特異性還是非特異性等。我們正在發(fā)現(xiàn)越來越多的免疫細(xì)胞標(biāo)志物。”Kinetic River 總裁兼創(chuàng)始人Giacomo Vacca 對 William Telford 關(guān)于COVID-19 和免疫學(xué)影響的看法表示贊同。他談到，“在免疫學(xué)等領(lǐng)域，我們看到應(yīng)用推動了對更好工具的需求。

　　像大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)工具一樣，流式細(xì)胞儀是一種復(fù)雜的儀器，它依賴于包括流體力學(xué)、計算機科學(xué)以及光學(xué)和光子學(xué)在內(nèi)的多學(xué)科融合。在典型的應(yīng)用中，樣本（例如異質(zhì)細(xì)胞群）被熒光標(biāo)記的抗體標(biāo)記，然后注入微流體腔室，在該腔室中通過激光束激發(fā)熒光團，檢測器記錄發(fā)射和散射的光，并將結(jié)果發(fā)送到計算機進(jìn)行分析。

　　雖然這項技術(shù)可以追溯到20 世紀(jì)50 年代，但目前設(shè)備的使用情況，已經(jīng)完全看不到其原始樣機的影子。一些最先進(jìn)的設(shè)備要包含多達(dá)10 個激光器，它們可以發(fā)出不同波長的光束。William Telford 說：“我們已經(jīng)看到技術(shù)的根本變化將繼續(xù)影響該領(lǐng)域。” 在過去三十多年，他一直是該技術(shù)領(lǐng)域的研究人員和專家，他的設(shè)施為許多與美國國家癌癥研究所合作的學(xué)術(shù)和臨床研究人員提供了支持。

　　越來越多的標(biāo)簽

　　在過去十年，William Telford 見證了研究人員用來定義細(xì)胞群體的細(xì)胞表面標(biāo)記物和熒光探針數(shù)量翻了一番。他說：“我們最多可以使用商業(yè)儀器對40 色熒光參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記。我們正在利用各種各樣的可見激光波長。”

　　Giacomo Vacca 說，這些參數(shù)的數(shù)量是很重要的，因為它們可以讓科學(xué)家精確地描述看似相似的細(xì)胞群。然而，標(biāo)簽數(shù)量的增加也帶來了潛在的挑戰(zhàn)。熒光團的光譜尾很長，導(dǎo)致其發(fā)射物從一個檢測通道溢出到另一個檢測通道。因此，研究人員需要合適的激光器、檢測器和計算算法，以區(qū)分重疊信號。Giacomo Vacca 補充說：“添加的標(biāo)簽越多，補償問題就越復(fù)雜。

　　流式細(xì)胞儀和儀器制造商已經(jīng)設(shè)計出增加研究人員可用標(biāo)簽數(shù)量的方法，而不必依賴諸如色彩補償之類的數(shù)學(xué)過程，色彩補償是用于區(qū)分光譜重疊。William Telford 說，一種方法是將標(biāo)簽推到可見光范圍之外并進(jìn)入紫外線。 Giacomo Vacca 同意這種方法：“在1990 年代后期將固態(tài) 355nm 激光器商業(yè)化引入之后，提供激發(fā)波長的流式細(xì)胞儀開始緩慢增長?；瘜W(xué)家據(jù)此開發(fā)出了熒光團。”

　　William Telford 的實驗室和其他實驗室正在使用空間分離的連續(xù)波激光器，來激發(fā)可見光和紫外區(qū)域的熒光團。他談到，探測技術(shù)也很重要，其研究團隊已經(jīng)開始使用電子崩光電二極管陣列來捕捉熒光信號，而不是傳統(tǒng)的光電倍增管。

　　William Telford 表示，另一項獲得關(guān)注的發(fā)展是光譜流式細(xì)胞儀。這種技術(shù)是迭代使用CCD 進(jìn)行檢測，它捕獲每個激發(fā)熒光團的全光譜，而不是特定的發(fā)射波長。這樣可以更好地區(qū)分標(biāo)簽。他認(rèn)為10 年內(nèi)光譜技術(shù)將成為主導(dǎo)技術(shù)。

　　Kinetic River 公司的Giacomo Vacca 則采取了不同的方法。為了補償光譜重疊，該公司制造的流式細(xì)胞儀可以計算每個熒光團的熒光持續(xù)時間或壽命，而不僅僅是測量出其發(fā)射波長。然而，為了做到這一點，他們必須從連續(xù)波激光器切換到脈沖激光器。

　　“熒光壽命給了我們一個額外的參數(shù)來區(qū)分光譜相似的分子，”Giacomo Vacca 說，“你可以用多個熒光團標(biāo)記細(xì)胞，例如所有熒光團都在藍(lán)色區(qū)域發(fā)出，并通過測量信號衰減來區(qū)分它們。”通過在數(shù)據(jù)分析中添加補償方法，他相信，細(xì)胞分析學(xué)家可以進(jìn)一步增加參數(shù)的數(shù)量，超出目前可能的范圍。William Telford 說：“通過觀察，將會發(fā)現(xiàn)一些有趣的生物學(xué)應(yīng)用。”

　　根據(jù)Giacomo Vacca 的說法，測量信號衰減的另一個好處是能夠消除內(nèi)源性熒光團，即自發(fā)熒光的背景。他說： “對所有實驗者來說，這是一件令人討厭的事，越深入紫外線區(qū)域，情況就越糟糕。”

　　激光解決方案

　　William Telford 和Giacomo Vacca 都將流式細(xì)胞儀的進(jìn)展，歸功于在可見光和紫外區(qū)域大量可選用的激光器。“關(guān)于流量的好處是，有了改進(jìn)的光學(xué)器件和檢測器，將不再需要大量的激光能量，”William Telford，“我們現(xiàn)在使用的是相對低功率的激光器，因為細(xì)胞在光束中的停留時間很短。”

　　硅谷初創(chuàng)企業(yè)

　　歐司朗光電半導(dǎo)體公司的高級應(yīng)用工程師Ann Russell 回憶稱：當(dāng)年，流式細(xì)胞儀使用的激光器主要是氣體離子工具，像大學(xué)宿舍冰箱一樣大。她認(rèn)為直接傳輸和二極管激光技術(shù)的進(jìn)步有助于減小儀器的尺寸，同時提高其質(zhì)量。“ 我們的單模激光束非常干凈，它們正是流式細(xì)胞儀客戶正在尋找的東西。”她補充說，改進(jìn)的波導(dǎo)也有助于提高光束質(zhì)量。

　　Ann Russell 指出，在當(dāng)今的許多激光器上，研究人員可以通過調(diào)節(jié)二極管的溫度，使其波長變化可達(dá)15nm。她說： “這就提供了一些額外的選擇，即不必進(jìn)入紫外線區(qū)域，因為紫外線會引起電離。”經(jīng)濟性和微型化的結(jié)合可以將流式細(xì)胞儀推向新的領(lǐng)域。在Ann Russell所在的北加利福尼亞州，生物技術(shù)初創(chuàng)公司通常會使用該技術(shù)。

　　William Telford 也看到了該領(lǐng)域的爆炸式增長?，F(xiàn)在有比以往更多的工具和更多的公司。他認(rèn)為可以執(zhí)行自我分析的小型臺式設(shè)備將在改善世界偏遠(yuǎn)地區(qū)個人健康方面發(fā)揮作用。例如，在加德滿都的診所不需要將易腐爛的樣品送到印度的一家醫(yī)院。大量使用這些儀器產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可能會促進(jìn)先進(jìn)計算技術(shù)在流式細(xì)胞術(shù)的使用。“要擁有優(yōu)秀的人工智能，你需要大量的數(shù)據(jù)支撐，”Ann Russell 說，“但我們?nèi)祟惿瞄L生成數(shù)據(jù)。”

　　William Telford 還指出了流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析改進(jìn)的趨勢，部分原因是可檢測參數(shù)數(shù)量的增加。他說：“無論是人工智能還是機器學(xué)習(xí)，我們都開始采用人們一直使用的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)工具。這將幫助我們更好地可視化復(fù)雜的多參數(shù)數(shù)據(jù)，并獲得我們之前無法獲得的結(jié)果。”

　　納米流

　　正如流式細(xì)胞儀越來越小一樣，它們的靶標(biāo)也越來越小。 Giacomo Vacca 說：“一個非常重要的研究領(lǐng)域是測量亞微米粒子。”亞微米和納米級流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)利用了技術(shù)改進(jìn)的融合以及對短波長激光器的推動。

　　John Tilton 是凱斯西儲大學(xué)的營養(yǎng)學(xué)副教授，他在該大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)中心指導(dǎo)免疫生物學(xué)項目。2020 年底，他的實驗室報告使用納米級流式細(xì)胞儀分析了感染該病毒的患者中HIV 蛋白酶活性的變異性。他說，這是該技術(shù)首次被用于直接測量酶活性，也是首次報道使用納米級流量來觀察患者來源的病毒。

　　John Tilton在使用流式細(xì)胞儀方面已有20多年的經(jīng)驗，并且他對確定病毒是否像細(xì)胞一樣具有異質(zhì)性非常感興趣。他說：“當(dāng)你在教科書中看到病毒圖片時，它們看起來都很完美。但是我們知道他們實際上不是，并且我們想知道是否可以發(fā)現(xiàn)具有臨床意義的差異。”

　　John Tilton 的小組表達(dá)了從感染了HIV 的患者細(xì)胞中提取的病毒基因序列，以及一個含有FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）熒光標(biāo)記對的報告基因構(gòu)建體，這些熒光標(biāo)記被HIV 蛋白酶切割位點隔開。研究人員用488nm波長激光刺激了該構(gòu)建體，并開發(fā)了一種稱為熒光閾值的技術(shù)，該技術(shù)可識別低水平的熒光，以檢測發(fā)射的變化，這在以前可能會被當(dāng)作背景排除。只有從病毒序列表達(dá)的活性蛋白酶才能有效地裂解該構(gòu)建體，從而抑制了熒光共振能轉(zhuǎn)移。 突變酶沒有這種能力。

　　John Tilton 發(fā)現(xiàn)，HIV 蛋白酶活性的異質(zhì)性反映了這些病毒的傳染性以及它們對蛋白酶抑制劑的耐藥性，蛋白酶抑制劑是HIV 治療的主要形式之一。他進(jìn)一步指出，由于病毒是如此之小，因此必須針對納米級流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)化激光束寬度以及其他技術(shù)問題。但他認(rèn)為，這項技術(shù)將會像細(xì)胞分析一樣成為常規(guī)技術(shù)。John Tilton 說：“它的靈敏度真是令人難以置信。”他的實驗室正在建造自己的儀器。

　　他說：“就更好地了解病毒和免疫學(xué)而言，我認(rèn)為納米級流式細(xì)胞儀發(fā)揮著重要作用。這對基于病毒顆粒的疫苗，基因療法和癌癥的病毒治療具有重要意義。”William Telford 有同樣的見解。他說：“這是一個令人興奮的時刻，因為有很多新的儀器和技術(shù)正在開發(fā)中。”

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