綜合編譯：John Xie

　　生物療法的概覽

　　過去幾十年來，藥物開發(fā)領(lǐng)域發(fā)生了重大變化，尤其是在大分子生物治療領(lǐng)域。在不斷增長的市場中，生物治療藥物的治療特異性帶來了許多模式選擇。與傳統(tǒng)的小分子藥物相比，大分子藥物除了具有精確的靶向能力外，還有可能帶來更高的經(jīng)濟(jì)回報(bào)。借鑒生物療法的成功經(jīng)驗(yàn)，生物仿制藥也正在被開發(fā)為具有成本效益的替代品，以取代價(jià)格高昂的第一代藥物。

　　對于大分子藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，技術(shù)的重點(diǎn)是推進(jìn)價(jià)值鏈的上游和下游階段。對藥物設(shè)計(jì)上游關(guān)鍵因素的關(guān)注，使公司能夠預(yù)測和預(yù)防可能導(dǎo)致藥物審批延誤或代價(jià)高昂的召回的下游問題。從單克隆抗體到雙特異性抗體和多特異性抗體，再到納米抗體和重組蛋白，生物治療的重要性在各種類型中不斷擴(kuò)大。每種方式都提供了多種預(yù)防或治療疾病的選擇，如風(fēng)濕病、癌癥、糖尿病、貧血、傳染病等。

　　細(xì)胞系開發(fā)，曲折的歷程

　　生物治療藥物開發(fā)的上游工作流程在細(xì)胞系開發(fā)（cell linedevelopment，CLD）、克隆選擇、放大、自動(dòng)化和數(shù)字化方面取得了重大進(jìn)展，從而提高了精確度和生產(chǎn)率。生物治療價(jià)值鏈上的這些變革性進(jìn)步也有助于提高靈活性和監(jiān)管合規(guī)性。新冠疫情加快了將藥物推向市場的進(jìn)程，同時(shí)還能保持較高的質(zhì)量、安全性和有效性標(biāo)準(zhǔn)。從 COVID-19 的經(jīng)驗(yàn)中，作為科學(xué)家和創(chuàng)新者，我們了解到疫苗、小分子和大分子藥物以及相關(guān)生物治療藥物的開發(fā)需要藥物開發(fā)商、技術(shù)提供商、供應(yīng)鏈組織和監(jiān)管機(jī)構(gòu)在全球范圍內(nèi)開展更多合作。

　　CHO 細(xì)胞系被廣泛用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)，而最近通過基因編輯等新一代技術(shù)對 CHO 細(xì)胞進(jìn)行工程改造的進(jìn)展，使基因敲除細(xì)胞系的特性得到了增強(qiáng)。使用 CRISPR/Cas9 的基因組編輯系統(tǒng)通過 CRISPR 系統(tǒng)介導(dǎo)的雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB），在基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控或基因敲除、基因敲入或整合感興趣基因（gene-of-interest，GOI），在了解基因功能方面發(fā)揮了強(qiáng)大的作用。

　　在大分子生產(chǎn)的上游階段，CLD 是一個(gè)漫長、耗時(shí)的過程，而且由于克隆的不穩(wěn)定性和相關(guān)蛋白的可接受表達(dá)水平，CLD仍然具有挑戰(zhàn)性。

　　產(chǎn)品變異性可在 CLD 過程的不同階段產(chǎn)生，包括但不限于轉(zhuǎn)染過程中的變異性、宿主細(xì)胞中基因整合的隨機(jī)性（可導(dǎo)致克隆異質(zhì)性）以及轉(zhuǎn)基因的不穩(wěn)定性和/或沉默。因此，穩(wěn)定的克隆細(xì)胞庫被用于 GMP 生產(chǎn)，以盡量減少最終產(chǎn)品的變異性。然而，隨著目前的臨床競賽，越來越多的研究小組正努力在生產(chǎn)過程的早期實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量的均一性，從而使臨床前研究能夠使用在 CLD 早期階段生產(chǎn)的材料（即細(xì)胞池）。

　　基于轉(zhuǎn)座子的技術(shù)

　　為了克服上述限制，人們利用稱為轉(zhuǎn)座子（transposons）的遺傳元件作為載體，將 GOI 植入宿主基因組。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（ 如Sleeping Beauty、Leap-in、PiggyBac 和 Tol2）優(yōu)先將 GOI 整合到活躍的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)上，使細(xì)胞系得以快速發(fā)展，并產(chǎn)生高滴度的重組蛋白。因此，轉(zhuǎn)座子是將 GOI 運(yùn)送到基因組中的理想載體。

　　DNA 轉(zhuǎn)座子由轉(zhuǎn)座酶基因和倒位末端重復(fù)序列（inverted terminal repeat，ITR）組成。轉(zhuǎn)座酶的活性和轉(zhuǎn)座子片段插入基因組位點(diǎn)是通過“剪切- 粘貼“機(jī)制進(jìn)行的。利用轉(zhuǎn)座子傳遞重組基因的基本載體設(shè)計(jì)包括 GOI 和選擇標(biāo)記，兩側(cè)是 ITR，轉(zhuǎn)座子上的轉(zhuǎn)座酶基因位于單獨(dú)的載體上。不過，為了控制轉(zhuǎn)座酶基因的活性，從而控制基因貨物的流動(dòng)性，轉(zhuǎn)座酶通常以 mRNA 的形式提供。使用基于轉(zhuǎn)座子的載體實(shí)際上消除了轉(zhuǎn)座子載體骨架上存在的細(xì)菌元件整合的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因的整合是由轉(zhuǎn)座酶催化的，它能特異性地識(shí)別 GOI 和選擇盒側(cè)翼的ITR。此外，這種表達(dá)系統(tǒng)提高了不同轉(zhuǎn)染之間的可重復(fù)性，從而提高了克隆的穩(wěn)定性。

　　基于轉(zhuǎn)座子的技術(shù)和成熟的 CHO 細(xì)胞系已被采用于 CLD 和大分子表達(dá)工作流程中?；谵D(zhuǎn)座子的表達(dá)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)多拷貝、非片段化基因盒整合。這種轉(zhuǎn)座子方法可使基因和表型水平上的克隆穩(wěn)定性大于 95%，最大限度地減少了克隆篩選工作，從而簡化了工藝開發(fā)并簡化了規(guī)?；a(chǎn)。

　　這種技術(shù)通常由兩部分組成，即轉(zhuǎn)座子載體和轉(zhuǎn)座酶（最好是 mRNA 形式），兩者可共同轉(zhuǎn)染到 CHO 細(xì)胞系中。mRNA 翻譯后，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶催化轉(zhuǎn)基因切除并整合到細(xì)胞系基因組中。與隨機(jī)整合表達(dá)載體相比，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它允許表達(dá)盒在每個(gè)整合位點(diǎn)完整整合（圖 1），因此不會(huì)出現(xiàn)任何片段化（圖 2B）、重排（圖 2C）或并合（圖2D）。因此，將 GOI 定向整合到細(xì)胞系基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)，可使細(xì)胞系的同質(zhì)性和克隆穩(wěn)定性超過 95%。

　　未來展望

　　在過去的幾十年中，大分子藥物開發(fā)在上游和下游階段都取得了進(jìn)展，包括簡化流程、建立關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CriticalQuality Attributes，CQA)、合規(guī)要求以及支持工作流程的技術(shù)。從生物學(xué)和技術(shù)角度來看，生產(chǎn)大分子藥物的上游細(xì)胞系開發(fā)是一個(gè)關(guān)鍵和奠基性的步驟，它不僅有助于提高產(chǎn)品滴度產(chǎn)量和擴(kuò)大規(guī)模，而且還確定了消除細(xì)胞偽影和最終純化藥物所需的技術(shù)。

　　如上所述，CHO 細(xì)胞系長期以來一直被廣泛用于蛋白質(zhì)藥物的表達(dá)和生產(chǎn)。最近的基因編輯和 GOI 運(yùn)送載體以及相關(guān)機(jī)制實(shí)現(xiàn)了有針對性的、一致的細(xì)胞系工程。

　　轉(zhuǎn)座子技術(shù)提供了特定的啟動(dòng)平臺(tái)，簡化了開發(fā)過程，減少了生產(chǎn)工作量。通過自動(dòng)細(xì)胞評估技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)和克隆選擇方法的進(jìn)一步發(fā)展和標(biāo)準(zhǔn)化，將進(jìn)一步簡化細(xì)胞培養(yǎng)過程中的端到端工作流程。將流程和協(xié)議與自動(dòng)化、檢測和細(xì)胞成像技術(shù)以及數(shù)據(jù)分析和管理相結(jié)合，將重新定義上游細(xì)胞系開發(fā)的流程。機(jī)器學(xué)習(xí)將進(jìn)一步促進(jìn)先進(jìn)的預(yù)測和數(shù)據(jù)模型，以建立最佳實(shí)踐并消除流程差距?？绺鞣N功能和流程領(lǐng)域的組合協(xié)作方法將促成下一代生物制劑模型的精確性、可靠性和有效性。

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